Infekcyjny klon cDNA wirusa zielonej mozaiki ogórka (CGMMV) i sposób jego wytwarzania oraz zastosowanie do produkcji infekcyjnych cząsteczek wirusa
ZESPÓŁ AUTORSKI
Instytut Ochrony Roślin - Państwowy Instytut Badawczy w Poznaniu
- prof dr hab. Beata Hasiów-Jaroszewska - kierownik
- mgr inż. Daria Budzyńska
CO MOŻNA OSIĄGNĄĆ DZIĘKI WYNALAZKOWI?
Wirusy powodują znaczne straty w uprawach roślin gospodarczo-ważnych co stanowi poważne zagrożenie dla światowego bezpieczeństwa żywności. Wirusy są patogenami wewnątrzkomórkowymi i brak jest środków chemicznych umożliwiających ich bezpośrednie zwalczanie stąd też wiedza dotycząca molekularnych podstaw infekcji i mechanizmów warunkujących odporność roślin odgrywa kluczową rolę w projektowaniu strategii zwalczania chorób wirusowych. Jednym z narzędzi umożliwiających poszerzenie tej wiedzy są sztuczne konstrukty genetyczne, które wprowadzone do roślin umożliwiają uzyskanie infekcyjnych kopii wirusa. Infekcyjny klon cDNA wirusa zielonej mozaiki ogórka (CGMMV), stanowiący prezentowany wynalazek, umożliwia w sposób kontrolowany, stabilny, precyzyjny i wydajny odtworzenie infekcyjnego wirusa zielonej mozaiki ogórka w roślinie (uzyskanie jego infekcyjnych kopii). Ponadto konstrukt ten umożliwia manipulację genomem wirusa (np. zmianę pojedynczych/wielu nukleotydów w RNA) dzięki czemu jest doskonałym narzędziem do badania właściwości biologicznych CGMMV, jego oddziaływań z gospodarzem i projektowania nowych narzędzi diagnostycznych.
ISTOTA WYNALAZKU
Wirus zielonej mozaiki ogórka (cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV), należący do rodzaju Tobamovirus, stanowi obecnie największe zagrożenie dla upraw roślin dyniowatych. Rośliny dyniowate (Cucurbitaceae) należą do głównych warzyw (ogórki, kabaczki, melony, arbuzy i inne) uprawianych na całym świecie, a ich globalna produkcja szacowana jest na ok. 151 milionów ton. Zwalczanie CGMMV jest bardzo trudne ponieważ wirus bardzo łatwo przenosi się przez kontakt roślina-roślina, z nasionami, zakażonymi sadzonkami i co istotne jego cząsteczki mogą przetrwać w wodzie i glebie. W ostatnim czasie obserwowano nasilone występowanie patogenu w Polsce w uprawie ogórka szklarniowego, przekładające się na straty w jakości i ilości plonów. Istotą wynalazku jest konstrukt genetyczny - infekcyjny klon cDNA pJL 89-CGMMV-OK17 i sposób jego wytwarzania. Konstrukt ten stanowi kolista cząsteczka DNA zbudowana z wektora plazmidowego pJL 89 o wielkości ~4681 par zasad oraz następującego po nim insertu stanowiącego genom izolatu wirusa zielonej mozaiki ogórka (CGMMV) o wielkości ~6422 par zasad. Wektory plazmidowe (stanowiące zmodyfikowane, koliste cząsteczki DNA naturalnie występujące u bakterii, tzw. plazmidy) są powszechnie wykorzystywanym narzędziem biologii molekularnej, umożliwiającym namnażanie dowolnego fragmentu materiału genetycznego czy ekspresję wstawionej do nich sekwencji DNA kodującej białko. Zastosowany do konstrukcji wynalazku komercyjnie dostępny wektor pJL 89 jest wektorem binarnym, który w swojej budowie posiada specyficzny fragment T-DNA umożliwiający powielenie wstawionego fragmentu DNA (insertu) nie tylko w komórkach bakteryjnych, ale również w komórkach roślin. Ponadto wektor ten posiada sekwencje podwójnego promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV 35S), rybozymu wirusa zapalenia wątroby typu delta i terminator. Fragment DNA odpowiadający powielonemu genomowi izolatu CGMMV-OK17 (insert), obejmuje sekwencje niekodujące oraz usytuowany pomiędzy nimi fragment kodujący białka odpowiedzialne za replikację wirusa, za jego przemieszczanie się w roślinie oraz białko płaszcza. Przygotowany konstrukt genetyczny poddany wcześniejszej selekcji w komórkach bakteryjnych, a następnie wprowadzony do rośliny na drodze agroinokulacji (proces wprowadzenia konstruktu do komórek roślinnych z wykorzystaniem laboratoryjnych szczepów Agrobacterium) umożliwia wyprodukowanie infekcyjnych cząsteczek wirusa w roślinie.
POTENCJAŁ KOMERCJALIZACYJNY WYNALAZKU
Ze względu na brak środków umożliwiających bezpośrednie zwalczanie wirusów stworzona przez nasz zespół infekcyjna kopia CGMMV, umożliwiająca odtworzenie wirusa w warunkach laboratoryjnych, może znaleźć szerokie zastosowanie w fitopatologii, hodowli i ochronie roślin: i) konstrukt umożliwia manipulację genomem wirusa np. wprowadzanie różnych mutacji do genomu i analizę odpowiedzi rośliny na infekcję w kontekście poszukiwania genów związanych z odpornością/tolerancją w pracach hodowlanych (szybsze i bardziej precyzyjne tworzenie nowych odmian roślin) ii) konstrukty mogą być wykorzystane w pracach nad skutecznością wirusobójczych chemicznych środków dezynfekcyjnych do stosowania np. w szklarniach na różnych powierzchniach iii) infekcyjne kopie mogą również służyć do tworzenia wirusów o obniżonej zdolności wywoływania objawów do wykorzystywania w ochronie krzyżowej jako ,,szczepionki” (zakażenie łagodnym wariantem celem ochrony roślin przed bardziej zjadliwym).